药学分子生物学笔记5

  第五章 转录、转录后加工

 

  ★转录：生物体以DNA为模板，在RNA聚合酶催化下合成互补的RNA分子的过程

 

  转录单位（transcription unit）：从启动子到终止子，被转录成单个RNA分子的一段DNA序列

 

  ★复制和转录的相同点

 

  1都以DNA为模板

 

  2原料为核苷酸

 

  3合成方向均为5′→3′方向

 

  4都需要依赖DNA的聚合酶

 

  5遵守碱基互补配对规律

 

  6产物为多聚核苷酸链

 

  ★复制和转录的区别

 

  作为RNA合成模板的链称为反意义链（模板链/负链）；与其互补的链称有意义链（编码链/正链） 原核生物RNA聚合酶（RNA polymerase ） 全酶 = 核心酶（α2ββ’）＋ σ因子

 

  1， α亚基决定转录的基因

 

  2， β亚基在5’ →3’方向上延长多核苷酸链

 

  3， β’亚基结合DNA模板

 

  4， σ因子识别“启动子”并与之结合

 

  真核的RNA聚合酶

 

  酶

 

  转录产物 鹅膏蕈碱敏感性

 

  RNA聚合酶Ⅰ 大部分 rRNA 不敏感

 

  RNA聚合酶Ⅱ hnRNA 敏感

 

  RNA聚合酶Ⅲ tRNA、

 

  5srRNA 、snRNA前体

 

  中度敏感

 

  ★启动子：RNA聚合酶识别、结合并起始转录的一段高度保守性DNA序列

 

  ★原核生物启动子结构

 

  -10区：TATA区（Pribnow box），RNA聚合酶的牢固结合位点 -35区：TTGACA区，与RNA聚合酶的σ因子相互识别

 

  -35 和-10区域之间的间隔17bp最佳。不影响转录起始但对转录效率十分重要 （大肠杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区） 图

 

  ★真核生物启动子

 

  RNA聚合酶I的启动子

 

  1.核心启动子（core promoter），由-45～＋20位核苷酸组成，单独存在时就足以起始转录。 2.由-170 ～ -107位序列组成，称为上游调控元件，能有效地增强转录效率 3.转录成rRNA

 

  RNA聚合酶Ⅲ启动子

 

  1.负责转录的是5SrRNA、tRNA和某些snRNA

 

  2 .5S rRNA和tRNA基因的启动子是内部启动子（internal promoter）位于转录起始位点的下游 ，都由两部分组成

 

  3.第三类启动子由三个部分组成，位于转录起始位点上游

 

  RNA聚合酶Ⅱ启动子

 

  1 起始子：转录起始的第一个碱基多为A，两侧各有若干嘧啶核苷酸

 

  2 TATA box： -25～ -35区含TATA序列，是转录因子与DNA分子结合的部位，使转录精确地起始 3 CAAT 框：-70 ～ -80区含CCAAT序列，控制转录起始的频率

 

  4 GC box：-80 ～ -110区含有GCCACCC或GGGCGGG序列，控制转录起始的频率 增强子（enhancer）：使和它相连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列 ①增强效应明显但与位置和取向无关 ②核心序列：TGTGGGTTTGG

 

  ③没有基因专一性但有严密的组织和细胞特异性 ④许多增强子还受外部信号的调控

 

  终止子（terminator） ：DNA分子中终止转录的核苷酸序列 。 1.不依赖Rho （ρ）因子的转录终止 2.依赖Rho （ρ）因子的转录终止

 

  依赖因子的终止：有些终止位点不形成强的发夹结构，需用ρ蛋白来帮助转录终止因子：：六聚体蛋白、水解各种核甘三磷酸促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。

 

  ★原核和真核生物转录启动子的比较

 

  1原核启动子结构类型少，真核生物每种类型的RNA聚合酶均有自己的启动子 2原核启动子与真核生物RNA聚合酶II的启动子更接近，其基本功能单位由起始子和TATA保守区组成

 

  3原核与真核生物RNA聚合酶II转录起始点第一个碱基均为嘌呤碱

 

  4原核启动子范围较小，真核生物RNA聚合酶II的调控区域较大

 

  5除Pribnow box外，原核启动子上游只有Sextama box，真核除含有CAAT box还有GC框、八聚体框和增强子等

 

  原核生物的转录 1转录起始：

 

  ①核心酶在σ因子的参与下，与模板DNA接触， 生成非专一性的，不稳定的复合物在模板上移动 ②起始识别：σ亚基发现识别位点后，

 

  与-35区序列结合形成一个封闭的启动子复合体“酶-启动子二元复合物” 转录起始分为三步：

 

  RNA聚合酶结合到识别位点上 移动到起始位点上

 

  建立一个开链式启动子复合物

 

  ③全酶紧密地结合在启动子的-10序列处，模板DNA局部变性，形成“开放的启动子二元复合体” ④酶移动到转录起始点，第一个rNTP转录开始， σ因子释放，形成“酶-启动子-rNTP三元复合体” 2 RNA链的延伸

 

  ①核心酶向前移动， NTP不断聚合，RNA链不断延长

 

  ②核心酶覆盖双链DNA和RNA复合物，向前推进，边解开螺旋边释放出新合成的RNA链，已经转录的区域中分开的DNA链又重新形成双螺旋 RNA链延伸的暂停。

 

  1 RNA聚合酶在DNA上的移动速度不均匀，在经过富含G.C 的序列 8-10个核苷酸后，发生暂停。 2 在RNA链的终止和释放过程中起重要作用 3 转录终止。

 

  ①酶停止向正在延伸的RNA链添加核苷酸，开放三元复合物解体。 ②终止既需DNA上可识别的终止序列，也需RNA产物的发夹结构 ③两类终止子：依赖与不依赖ρ因子的终止子

 

  真核生物的转录

 

  1 三种RNA pol识别不同启动子。

 

  2 转录起始过程需要很多转录因子（transcription factor， TF ）参与，按一定顺序与DNA形成复合物，协助RNA pol定位于转录起始点

 

  3 RNA-pol前移处处都遇上核小体，转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象 真核生物转录的终止 爪蟾转录终止位点：

 

  T2、T3均含有7个碱基的保守序列5’—GACTTGG—3’ T2是前体rRNA转录的初始终止位点 T3是“失败-保险终止位点”

 

  转录的抑制作用

 

  阻断、抑制或干扰RNA的代谢过程，最终抑制转录的一类化合物 1嘌呤或嘧啶类似物：巯基嘌呤、氟尿嘧啶

 

  2通过与DNA结合改变模板的功能：烷化剂、放线菌素、溴乙锭 3与RNA酶结合影响其活力：

 

  利福平/利福霉素—与原核细胞RNA聚合酶的β亚基非共价结合，阻止RNA转录的起始   α鹅膏蕈碱—真核生物RNA聚合酶Ⅱ的抑制剂

 

  转录后加工及其机制

 

  转录后加工：将各种前体RNA分子加工为成熟的各种RNA

 

  顺反子：与多肽链相对应的DNA片段连同启动部位和终止部位

 

  原核生物mRNA为多顺反子，即几个结构基因，利用共同的启动子和终止信号经转录成一条mRNA。 真核生物mRNA为单顺反子，即只含一个基因，一个mRNA分子编码一种蛋白质分子。

 

  原核生物转录产物的加工

 

  1，mRNA： 转录生成的初级转录本mRNA不需经过复杂的加工过程即可表现功能。多顺反子mRNA在RnaseⅢ的催化下裂解为单个的顺反子 2，rRNA的加工：

 

  ①E.coli 的rRNA有三种：16S，23S和5S。 ②初始转录物多为多顺反子 rRNA转录后加工包括：

 

  1剪切： 前体被RNaseⅢ、RNaseR等剪切 2修饰：修饰酶进行碱基修饰

 

  3装配： rRNA与蛋白质结合形成核糖体的大、小亚基

 

  3，tRNA的加工

 

  ①tRNA 初始转录本是多顺反子

 

  ②加工包括：

 

  A核酸内切酶在tRNA两端切断

 

  B核酸外切酶从3’端逐个切去附加顺序 C在3’端加上-CCA-OH D核苷酸的修饰

 

  参与tRNA后加工的酶

 

  1， RNAaseP：内切核酸酶，负责切割所有tRNA分子的5‘端。识别tRNA的空间结构

 

  2 RNAaseD：外切核酸酶，使Ⅰ型 tRNA露出CCA端。RNAaseP 存在时 RNAaseD可达最大活性

 

  3 tRNA核苷酸转移酶：以ATP和CTP为前体，催化 tRNA（Ⅱ型）的3’端生成CCA；CCA末端常丢失，该酶有修复作用；识别tRNA的空间结构，无种属特异性

 

  4 RNAase Ⅲ：与RNAaseO、RNAaseP2的功能相似，负责切开间隔序列

 

  真核生物转录产物的加工 1 mRNA前体的加工

 

  ①5’端形成特殊的帽子结构

 

  ②3’端切断一段序列并加上poly A尾巴 ③通过剪切去除由内含子转录来的序列 ④链内部核苷酸甲基化

 

  ⑤真核生物转录产物的加工

 

  1） 5’端加帽 帽子的三种类型：

 

  帽子0（Cap-0） m7GpppX（共有）— m7G；N7—甲基鸟苷

 

  帽子1 （Cap-1）m7GpppXm — 第一个核苷酸的 2’-O 位上产生甲基化 帽子2（Cap-2） m7GpppXmYm — 第二个核苷酸的 2’-O 位上产生甲基化 42

 

  5’端帽子结构的重要性：

 

  a. 翻译起始的必要结构，为IFⅢ（起始因子）和核糖体对mRNA的识别提供信号 b. 增加mRNA的稳定性，保护mRNA 免遭5’外切核酸酶的攻击 c. 运输，有助于mRNA越过核膜，进入胞质 2） 3’端加尾

 

  a、 大多数的真核mRNA 都有3’端的多聚尾巴（polyA），约为200bp。 b、 AATAA序列是加polyA尾信号。

 

  ★3′polyA尾巴的功能

 

  1与mRNA从细胞核转送到细胞质有关 2稳定mRNA结构，保持生物半衰期 3与真核mRNA的翻译效率有关：①缺失可抑制体外翻译的起始 ②含 poly（A） 的mRNA 失去 poly（A） 可减弱其翻译

 

  2. rRNA前体的加工

 

  初始转录本为45S前体，18S，5.8S和28S 是一个转录本

 

  5sRNA前体独立于其他三种rRNA的基因转录 前体rRNA与蛋白质结合，然后再切割和甲基化

 

  3. tRNA前体的加工

 

  ①真核的前体分子tRNA是单顺反子，成簇排列，基因间有间隔区； ②前体分子两端都有附加序列需核酸内切酶和外 切酶切除； ③3’端加CCA ；

 

  ④tRNA的前体分子中含有内含子需切除； ⑤碱基修饰

 

  RNA的剪接

 

  RNA剪接（RNA splicing） ：一个基因的外显子和内含子共同转录在一条转录产物中，将内含子去除而把外显子连接起来形成成熟RNA分子的过程

 

  1 内含子（intron） — 成熟RNA的序列中不出现的序列

 

  2 外显子（exon） — 在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列 内含子的分类

 

  1.Ⅰ类内含子 — 含有中部核心结构（细胞器基因、核基因 ）

 

  2.Ⅱ类内含子 — 不含有中部核心结构（细胞器线粒体基因、核基因 ） 3.Ⅲ类内含子 — 具有 GU-AG 特征的边界序列（核基因mRNA前体 ）

 

  4.IV类内含子 — tRNA基因的内含子（位于 tRNA 的反密码环上）       第I类含子的剪接— rRNA的自我剪接

 

  1结构特点： ①边界序列 5’U-G 3’ ②有由保守序列形成的二级结构 2剪接特点：

 

  A自我剪接：主要由转酯反应构成，完全由内含子自身完成

 

  B形成明显的二级结构：产生适于剪接反应的构象和活性位点，在G参与下完成剪接反应 第Ⅱ类内含子的剪接 结构特点

 

  （1） 边界序列 5’ GU-AG； （2） 二级结构：

 

  a. 有6个茎环结构， b. 分支点序列

 

  剪接特点 1）自我剪接 2）反应需要一价和二价离子，不需能量 第Ⅲ类内含子的剪接— hnRNA的剪接 剪接特点：

 

  a. 剪切过程和Ⅱ类内含子十分相似，

 

  b. 本身不能形成二级结构，依赖于snRNPs进行剪接 结构特点：

 

  1）边界顺序：符合GU-AG法则。

 

  2）分枝点顺序：内含子3′端上游18-40nt处，Py80NPy87Pu75APy95，A具有2’-OH。 3）内含子5’端有一保守序列5’GUAAGUA3’，和剪接体中U1 snRNA的5’端的3’CAUUUCAU5’互补。

 

  第Ⅳ内含子的剪接— tRNA的剪接 结构特点：

 

  1）位置相同，都在反密码子环的下游3’；

 

  2）内含子和反密码子配对形成茎环。

 

  3）不同tRNA的内含子长度和序列各异，14-46bp 剪接特点：

 

  （1） 没有边界序列，也没有内部引导序列；

 

  （2） 剪切反应的识别信号是 “三叶草” 的二级结构；  （3） 不是转酯反应。

 

  （4） RNase异体催化剪切内含子

 

  1.前体tRNA在核酸酶作用下，切除内含子序列，生成两个半分子tRNA

 

  2.反密码子环形成

 

  3.在RNA连接酶作用下生成成熟tRNA分子

 

  4.顺式和反式剪接

 

  A顺式剪接—在同一个基因内，切除内含子，连接相邻的外显子 B反式剪接—不同基因的外显子剪接

 

  RNA编辑（RNA editing）—在初级转录物上插入、剔除或置换一些核苷酸残基而改变遗传信息的基因调控方式，是转录后发生的另一个重要事件。

 

  

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